Dott. Massimo Crimi - Facoltà di Scienze - Università degli Studi di Verona
 

ATTIVITA’ DIDATTICA

Dal 1997 ad oggi:

Didattica:

·        1999/2000 e 2000/2001 - Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali

·         Docente del Corso di Fisiologia Vegetale;

·         Docente del Corso di Biochimica Vegetale.

·        2001/2002, 2002/2003, 2003/2004 - Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali

·         Docente del Corso di Fisiologia e Biochimica Vegetali (A.A. 2001/2002, 2002/2003, 2003/2004), 8 CFU + 1 CFU ;

·         Docente del corso di Fisiologia Vegetale (vecchio ordinamento, A.A. 2001/2002).

·        2004/2005, 2005/2006, 2006/2007, 2007/2008 - Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali;

·         Docente del Corso di Fisiologia e Biochimica Vegetali, modulo di Fisiologia Vegetale, 4 CFU + 1CFU.

·        2006/2007, 2007/2008, 2008/2009 – Corso di Laurea specialistica in Biotecnologie Molecolari e Industriali

·         Docente del Corso di Biosintesi e Maturazione delle Proteine, 2 CFU.

 

·        2007/2008, 2008/2009 - Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali;

·         Docente del corso di Chimica e Biochimica Analitica – modulo di Biochimica Analitica, 2 CFU + 1CFU.

·        2008/2009 - Corso di Laurea in Biotecnologie Agro-Industriali;

·         Docente del corso di Biologia Cellulare, 4 CFU + 1CFU.

·         Docente del corso di Biologia Vegetale, 2 CFU + 1 CFU

·        dal 2009 ad oggi - Corso di Laurea in Biotecnologie

·         Docente e coordinatore del corso di Biologia Generale e Cellulare, 12 CFU.



ATTIVITA’ SCIENTIFICA - Anni Accademici dal 1997 ad oggi

 Meccanismi molecolari di fotoprotezione
Il mio lavoro di ricerca nel triennio 1997-2000 ha avuto come tema principale lo studio del ruolo strutturale e funzionale dei carotenoidi nelle proteine antenna delle piante superiori. L’importanza di queste molecole è legata al ruolo chiave che giocano nei processi di fotoprotezione nelle piante superiori. Il meccanismo principale sotto indagine ha riguardato il non-photochemical quenching (NPQ) dell’energia di eccitazione. Questo meccanismo è dipendente dalla de-epossidazione della xantofilla violaxantina a zeaxantina. La localizzazione di questi pigmenti nelle subunità dei complessi del fotosistema I e II è di fondamentale importanza nello studio del meccanismo molecolare della fotoprotezione. Le ricerche svolte negli anni precedenti hanno evidenziato la localizzazione della violaxantina (legata) nelle tre subunità minori del fotosistema II chiamate CP29, CP26 e CP24 e di violaxantina associata debolmente nell’antenna maggiore LHCII. La zeaxantina, d’altro canto, è stata localizzata quasi esclusivamente legata alle antenne minori. Con una metodica, messa a punto in questo laboratorio, è stato possibile preparare proteine ricombinanti che legano tutti i pigmenti normalmente presenti nelle proteine antenna native, ovvero ricostituire in vitro le apoproteine sovraespresse in E.coli con estratti di pigmenti di membrane fotosintetiche. Il risultato più interessante è che i campioni ottenuti posseggono tutte le caratteristiche funzionali (studiate mediante emissione di fluorescenza in stato stazionario e risolte nel tempo, spettri di assorbimento, ecc.) e strutturali (dicroismo circolare, dicroismo lineare, stabilità, ecc..) riscontrate nei sistemi nativi. Queste qualità e la versatilità del metodo di ricostituzione in vitro hanno aperto la strada allo studio della funzione e della localizzazione all’interno dei sistemi antenna dei singoli carotenoidi. I risultati ottenuti hanno fornito importanti delucidazioni sul diverso ruolo dei carotenoidi all’interno delle antenne minori CP26 e CP29 (Figura1). Dal punto di vista strutturale la luteina e la violaxantina sono risultate le specie capaci di stabilizzare maggiormente la struttura proteica. La ricostituzione con zeaxantina ha anch’essa dato risultati positivi fornendo così un prezioso sistema per la comprensione del ruolo funzionale di questa xantofilla che è noto essere coinvolta direttamente nel processo di fotoprotezione (ciclo delle xantofille). Quando di utilizza la sola neoxantina, d’altro canto, non è possibile ottenere un sistema ricostituito stabile; questo risultato dipende dalla stringenza della metodica utilizzata che permette di selezionare la popolazione più stabile di proteina ricostituita con pigmenti. Le misure dei tempi di vita di fluorescenza delle clorofille legate da questi sistemi antenna e la resa quantica di fluorescenza della clorofilla a, in collaborazione con il Prof. Alfred. R. Holzwarth (MPI-Muelheim, Germania) e con il Prof. Harry Frank (Storrs, U.S.A.), hanno evidenziato il diverso ruolo funzionale delle xantofille legate da queste proteine nei processi di raccolta della luce e di dissipazione dell’energia di eccitazione.

 Modello strutturale di CP29 ed orientamento dei dipoli delle clorofille
L’omologia di sequenza tra le regioni transmembrana delle antenne minori ed LHCII (di cui è disponibile la struttura risolta a 3.4 Å con cristallografia elettronica) ci ha permesso di costruire un modello strutturale di CP29 e di verificare la posizione dei residui coinvolti nella coordinazione delle clorofille (Figura2). A partire da questo modello 3D ed utilizzando mutanti sito-specifici su questi residui (dai quali si sono ottenuti gli spettri di assorbimento e gli spettri di dicroismo lineare), è stato possibile calcolare l’orientamento dei momenti di transizione dipolare delle singole clorofille legate (Figura 3)

 Ca2+-binding
Si è studiato il legame del Ca2+ con la proteina antenna CP29. La marcatura con 45Ca2+ ha dimostrato che questa proteina è in grado di legare calcio. Studi spettroscopici della proteina purificata, dopo aver sostituito lo ione calcio con Itterbio (Yb3+) hanno confermato la presenza di un sito specifico di legame. La posizione di questo sito è stata identificata analizzando la sequenza primaria ed il modello strutturale tridimensionale: il sito è localizzato nel loop tra la prima e la seconda elica transmembrana, in una regione esposta al lume tilacoidale. Il legame del calcio potrebbe essere reversibile in funzione del pH rendendo la proteina un sensore dello stato energetico sulla membrana: Il distacco del calcio, quindi, funzionerebbe da switch per attivare i meccanismi di dissipazione dell'energia.

 PsbS
Recentemente, si è trovata un'altra proteina che sembra essere direttamente coinvolta nei meccanismi di dissipazione dell'energia (non photochemical quenching - NPQ) nel PSII: la subunità PSII-S (o PSbS). I mutanti di Arabidopsis che mancano del gene nucleace che codifica per PsbS è incapace di rispondere rapidamente all'eccesso di luce nonostante il ciclo delle xantofille sia inalterato. Per chiarire il ruolo di questa proteina nella fotoprotezione, abbiamo studiato le caratteristiche strutturali e funzionali e di legame con i pigmenti fotosintetici della proteina nativa e della proteina ricombinante espressa in E. coli. I risultati ottenuti mostrano che questa proteina non è in grado di legare stabilmente i pigmenti fotosintetici. I meccanismi molecolari di dissipazione devono quindi essere legati ad altre caratteristiche di questo sistema proteico. L'ipotesi da noi avanzata prevede un cambiamento conformazionale di questa proteina indotto dall'acidificazione del lume; questo cambiamento influenzerebbe il trasferimento dell'energia all'interno del PSII verso il centro di reazione e causerebbe un accumulo dell'energia di attivazione sulle antenne minori collocate in prossimità di PsbS. I risultati della marcatura di PsbS con 14C- DCCD sono a favore di questa ipotesi funzionale.
 

Plant Lipid Binding Proteins (nsLTPs) e apoptosi
Le LTP (lipid transfer proteins) sono piccole proteine basiche presenti in molti tessuti vegetali;  sono state identificate originariamente per la loro capacità di catalizzare lo scambio di lipidi tra membrane in vitro. In seguito, il ruolo proposto di scambiatori di lipidi intracellulari è stato messo in discussione poichè sono state trovate anche nell'ambiente extracellulare. Recentemente è stato proposto anche che possano avere un importante ruolo nei meccanismi di difesa da patogeni delle piante.
Queste proteine sono molto studiate anche per la loro capacità di indurre forti reazioni allergiche.
La struttura tridimensionale di queste proteine è nota: tutte sono formate da quattro alfa-eliche tenute assieme da ponti disolfuro. Queste quattro eliche formano una cavità idrofobica centrale nella quale può legarsi un lipide. Le molecole lipidiche trovate legate sono molte e di diversa natura, da acidi grassi a fosfolipidi. Il ruolo di questo legame e la funzione svolta da queste proteine resta ancora motivo di studio
Il progetto si propone di studiare le interazioni delle LTP estratte da diversi sorgenti (semi di mais, semi di frumento) con le membrane biologiche. Questo viene fatto utilizzando le LTP purificate, con lipidi legati e senza.
Si utilizzano membrane artificiali (liposomi) e membrane naturali (mitocondri) per verificare sia l'azione aspecifica sul doppio strato lipidico sia l'azione specifica, quella mediata da sistemi di membrana. Questo ultimo aspetto è di grande interesse perchè può fornire importanti informazioni sui meccanismi che controllano l'instaurarsi della risposta apoptotica dei mitocondri.  Si è infatti rovata una regione omologia di sequenza tra le LTP e la proteina pro-apoptotica Bid. Questa similitudine non si limita alla sequenza: è stato visto sperimentalemnte che Bid può legare e scambiare molecole lipidiche. Queste molecole potrebbero quindi agire come segnale per l'attivazione dell'apoptosi.
Su questo argomento di ricerca è stato presentato un poster al Congresso  Clicca il logo per visualizzarlo.

Bid e la scelta di attivare la morte programmata - Apoptosi

La proteina pro-apoptotica Bid si trova al crocevia delle due vie di attivazione cel processo apoptotico: la via intrinseca e la via estrinseca. Questa proteina è estremamente importante poiché agisce da sensore e può scatenare a valle l'attivazione delle proteine effettrici dell'apoptosi, quelle che agiscono direttamente sulla membrana esterna mitocondriale causando i cambiamenti irreversibili che scatenano l'esecuzione del processo di distruzione controllata della cellula. Lo studio delle caratteristiche strutturali e funzionali di questa proteina è di cruciale importanza per comprendere come si possa influenzare la scelta di attivare la morte programmata in cellule che hanno perso il controllo normale. Caratterizzare infatti i ligandi specifici (molecole lipidiche e derivati, quali i lisolipidi) e il sito di legame nella proteina ci potrà permettere di sviluppare nuove molecole in grado di influenzare il processo apoptotico. La proteina Bid ricombinante è anche utilizzata per studi di interazione proteina-proteina con altri membri della famiglia Bcl-2 per studiare il meccanismo di interazione con le proteine anti-apoptotiche attraverso anche il tentativo di cristallizzare il complesso per determinarne la struttura tridimensionale.




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